關(guān)鍵詞：慧穎生物提供高品質(zhì)PC-3M2B4細(xì)胞株，狀態(tài)良好，傳代次數(shù)靠前，*！

產(chǎn)品名稱：PC-3M2B4細(xì)胞

中文名稱：人前列腺癌低轉(zhuǎn)移細(xì)胞

規(guī)格：凍存管/25T培養(yǎng)瓶

貨期：10個(gè)工作日左右

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：無支原體，無污染

上海慧穎生物提供4000多種類細(xì)胞株細(xì)胞系，從源頭把控產(chǎn)品的可靠性，復(fù)蘇，凍存，傳代，培養(yǎng)，嚴(yán)格無菌操作，全國各地均可發(fā)貨，遠(yuǎn)到香港，澳門，內(nèi)蒙古，新疆石河子，寧夏，海南等地，全國訂購：！

原代細(xì)胞培養(yǎng)成功以后，需要進(jìn)行分離培養(yǎng)，否則細(xì)胞會因生存空間不足或密度過大，營養(yǎng)障礙，影響細(xì)胞生長。細(xì)胞由原培養(yǎng)瓶內(nèi)分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的過程稱之為傳代培養(yǎng)。傳代細(xì)胞允許培養(yǎng)的細(xì)胞擴(kuò)增(形成細(xì)胞株)，可以進(jìn)行細(xì)胞克隆，易于保存，但可能喪失一些特殊的細(xì)胞和分化特征。傳代PC-3M2B4細(xì)胞株形成細(xì)胞株的zui大利處在于提供了大量持久的實(shí)驗(yàn)材料，便于實(shí)驗(yàn)。1. 操作步驟（1）吸掉或倒掉培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。（2）向瓶內(nèi)加入胰蛋白酶液和EDTA混合液少量。以能覆蓋培養(yǎng)瓶底為宜。（3）置37℃孵箱或室溫（25℃溫度）下進(jìn)行消化，2~5min后把培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察，當(dāng)發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大后，應(yīng)立即中止消化。（4）吸出消化液，向瓶內(nèi)加入Hanks液少量，輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶，把殘留消化液沖掉，然后再加培養(yǎng)液。如果僅使用胰蛋白酶消化，在吸除胰蛋白液后，可直接加入少量含血清的培養(yǎng)液，終止消化。（5）使用彎頭吸管，吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，按順序反復(fù)輕輕吹打瓶壁細(xì)胞，使之從瓶壁脫離形成細(xì)胞懸液。吹打時(shí)動作要輕柔，以防用力過猛損傷細(xì)胞。（6）用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，分別接種于新的培養(yǎng)瓶中，置CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。（7）細(xì)胞培養(yǎng)換液時(shí)間應(yīng)根據(jù)細(xì)胞生長的狀態(tài)和實(shí)驗(yàn)要求來確定。一般2～3d后應(yīng)換一次生長液。待細(xì)胞鋪滿器皿底面，即可使用；也可繼續(xù)傳代擴(kuò)大培養(yǎng)或換成維持液。2. 注意事項(xiàng)（1）掌握好細(xì)胞消化的時(shí)間，消化時(shí)間過短時(shí)，細(xì)胞不宜從瓶壁脫落，過長的消化會導(dǎo)致細(xì)胞脫落、損傷。（2）掌握好消化濃度，當(dāng)消化液濃度過高時(shí)，消化時(shí)間應(yīng)縮短，過低時(shí)細(xì)胞消化時(shí)間相對延長。三、體內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)及其操作步驟1． 瘤細(xì)胞懸液接種（1）無菌選取生長良好(有光澤，淡紅色)瘤組織或?qū)?shù)生長期培養(yǎng)瘤細(xì)胞。   （2）在PBS中將瘤組織剪碎后用勻漿器研磨，經(jīng)80～100目篩網(wǎng)過濾成細(xì)胞懸液。（3）培養(yǎng)細(xì)胞應(yīng)用PBS洗兩遍。（4）計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度至107～108／ml。（5）常規(guī)消毒后，于接種部位(通常為背部或腋窩腹股溝皮下)用醫(yī)用注射器皮下潛行一段后注入細(xì)胞懸液(0.1ml／部位，＞106細(xì)胞)。初次接種成功率低，細(xì)胞數(shù)盡可能多一些。（6）次日注意觀察動物一般情況。初次接種一般有一段較長的潛伏期，以后隨著傳代潛伏期逐漸縮短，zui后固定為一個(gè)相對穩(wěn)定的時(shí)間。2． 腹水瘤的建立與腹水瘤的接種　將實(shí)體瘤細(xì)胞直接種于小鼠腹腔、腹壁或其他部位，引起腹水，腹水中含有瘤細(xì)胞，將這種腹水反復(fù)傳代，即可成為腹水瘤。初次傳代時(shí)，腹水常呈血性(含大量紅細(xì)胞)，反復(fù)傳代后腹水逐漸變成乳白色。腹水瘤的接種過程如下。（1）將凍存或培養(yǎng)的腹水瘤細(xì)胞離心和洗滌，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。（2）消毒動物，左下腹穿刺接種106腹水瘤細(xì)胞。（3）接種腹水瘤細(xì)胞后約7~12d，待小鼠腹部明顯膨大。用碘酒棉球消毒小鼠腹部，用9號針頭抽取腹水，也可行腹部解剖后，用滴管吸取。每只小鼠可抽3~5ml。（4）抽取的腹水經(jīng)3000rpm離心15min，收集上清，分裝凍存?zhèn)溆?。四、培養(yǎng)細(xì)胞的凍存及復(fù)蘇細(xì)胞低溫凍存是培養(yǎng)室常規(guī)工作和通用技術(shù)。細(xì)胞凍存在-196℃液氮中，儲存時(shí)間幾乎是無限的。細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的原則是慢凍快融。1． 凍存細(xì)胞（1）選對數(shù)增生期細(xì)胞(證明無支原體污染)，在凍存前1d換液。（2）按常規(guī)方法把培養(yǎng)細(xì)胞制備成懸液，計(jì)數(shù)，使細(xì)胞密度達(dá)5×107／ml左右密度，離心，去上清。（3）加入配制好的凍存液（培養(yǎng)液6.8ml，小牛血清2ml，DMSO 1ml，5.6%NaHCO3 0.1ml），按與去上清相同的量一滴一滴加入離心管中，然后用吸管輕輕吹打令細(xì)胞重懸。凍存細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)液中加入保護(hù)劑10％二甲基亞砜(DMSO) 或甘油，可使冰點(diǎn)降低，使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外。（4）分裝于無菌凍存管中，每管加1.5m懸液。（5）旋好凍存管并仔細(xì)檢查，一定要蓋緊，做好標(biāo)記。（6）凍存：在特殊的儀器或簡易的液氮容器中，按-1℃／min的速度，在30～40min時(shí)間內(nèi)，下降到液氮表面，再停30min后，直接投入液氮中。要適當(dāng)掌握下降冷凍速度，過快能影響細(xì)胞內(nèi)水分透出，太慢則促進(jìn)冰晶形成。操作時(shí)應(yīng)戴防護(hù)眼鏡和手套，以免液氮凍傷。2. 復(fù)蘇細(xì)胞（1）從罐中取出凍存管。（2）迅速放入36℃～37℃水浴，不時(shí)搖動，使其急速融化，30～60s內(nèi)完成。（3）凍存管用70％酒精擦拭消毒后，打開蓋子，用吸管將細(xì)胞懸液注入離心管中，再滴加10ml培養(yǎng)液。（4）低速離心(500～1000r／min) 5min，去上清后再用培養(yǎng)液洗一次。（5）用培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后，裝入培養(yǎng)瓶37℃培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液后，繼續(xù)培養(yǎng)。以后仍按常規(guī)進(jìn)行培養(yǎng)。凍存細(xì)胞數(shù)量要充分，密度應(yīng)達(dá)到107／ml，在融后稀釋20倍時(shí)，仍能保持5×105／ml數(shù)量。

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接種或傳代以后，實(shí)驗(yàn)者每天或至多間隔1～2d，要對細(xì)胞做常規(guī)性檢查。觀察細(xì)胞形態(tài)和生長情況以及培養(yǎng)的pH變化、有無污染等。根據(jù)細(xì)胞動態(tài)變化，做換液或傳代處理，如發(fā)現(xiàn)異常情況應(yīng)及時(shí)采取措施。1. 細(xì)胞形態(tài)　生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，在一般顯微鏡下觀察時(shí)可見，細(xì)胞透明度大、折光性強(qiáng)、輪廓不清。細(xì)胞生長不良時(shí)，輪廓增強(qiáng)，胞質(zhì)中常出現(xiàn)空泡、脂滴和其他顆粒狀物，細(xì)胞之間空隙加大，細(xì)胞形態(tài)可變得不規(guī)則甚至失去原有特點(diǎn)，如上皮細(xì)胞變成類上皮細(xì)胞等。某些染料當(dāng)細(xì)胞死亡時(shí)能透過變性的胞膜與解體的細(xì)胞核DNA結(jié)合，而令其著色。因而常用臺盼藍(lán)(trypan blue) 鑒別細(xì)胞死活，活細(xì)胞不著色，死細(xì)胞核呈藍(lán)色。2. 細(xì)胞生長　初代培養(yǎng)或傳代的細(xì)胞懸液接種以后，經(jīng)過長短不同的潛伏期后開始增殖。傳代細(xì)胞系、胚胎組織或幼體組織一般在第二天即可見細(xì)胞生長，一周內(nèi)便可連接成片。接種細(xì)胞長滿瓶壁后，應(yīng)及時(shí)做再培養(yǎng)。否則由于營養(yǎng)物消耗和代謝積累，細(xì)胞即進(jìn)入停止期或退化期。此時(shí)細(xì)胞輪廓增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)常出現(xiàn)顆粒狀堆積物，為膨脹的線粒體，細(xì)胞質(zhì)呈空泡化，細(xì)胞變圓、粗糙，嚴(yán)重時(shí)細(xì)胞從瓶壁脫落，只有及時(shí)再做傳代處理，才能使細(xì)胞繼續(xù)生長繁殖。3. 營養(yǎng)液　正常情況下，培養(yǎng)液呈桃紅色。如果細(xì)胞維持在pH6.5～6.6條件下，細(xì)胞會脫落死亡。當(dāng)培養(yǎng)液酸化變黃時(shí)，說明培養(yǎng)液中代謝產(chǎn)物已堆積到一定量，需要更換新鮮培養(yǎng)液。培養(yǎng)液中如加Hepes或用5％CO2溫箱培養(yǎng)可使pH維持相對穩(wěn)定。更換營養(yǎng)液的時(shí)間，可依營養(yǎng)物的消耗而定，細(xì)胞生長旺盛時(shí)2～3d換一次，生長緩慢時(shí)，3～4d亦可。要特別注意各種細(xì)胞對pH值要求是不一樣的。4. 微生物污染　微生物污染培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)物后會出現(xiàn)pH值改變，培養(yǎng)液呈現(xiàn)混濁狀。細(xì)菌感染后，由于細(xì)菌的運(yùn)動，光鏡觀察可見有微閃光；真菌感染則在鏡下見許多細(xì)絲狀菌絲，有時(shí)還密集有群集孢子；支原體的污染需要借助一些檢測手段才可檢出。細(xì)胞污染以后一般應(yīng)當(dāng)廢棄，對于重要的細(xì)胞株，可以參考相關(guān)專著，介紹采取一些措施清除污染。比較重要的實(shí)驗(yàn)、珍貴的細(xì)胞，至少由兩個(gè)實(shí)驗(yàn)人員獨(dú)立培養(yǎng)操作，或由一個(gè)人分次(不同時(shí))操作。除培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的衛(wèi)生條件外，空氣中的濕度與微生物污染關(guān)系密切。重要的、周期長的實(shí)驗(yàn)盡量安排在空氣濕度低的秋冬季進(jìn)行。