收到細胞后如何正確地處理細胞

以下由@慧穎細胞庫從事細胞培養(yǎng)工作的人員總結給出的建議：
   有經驗和剛剛從事細胞培養(yǎng)工作的人員都應該認真仔細地詢問下細胞提供方提供的建議，提前了解所要培養(yǎng)細胞的詳細資料，準備好細胞所要用到的培養(yǎng)基和相關試劑，雖然所有的貼壁，半貼壁或者懸浮細胞處理方式差不多，但是不同的實驗室培養(yǎng)條件和處理力度還有試劑的批間差這些問題存在，也會導致對細胞處理不當，或者環(huán)境的不適應而造成細胞的死亡。
1.收到細胞，*時間要鏡檢：觀察細胞形態(tài)是否正常，對于貼壁細胞則要注意看貼壁情況是否很好 ，觀察細胞密度，有疑議及時咨提供細胞的技術人員。 由于運輸的時間或者溫度的變化，很多貼壁細胞在盛滿培養(yǎng)基的瓶子里生長的狀態(tài)和平時會有點不一樣，主要是貼壁牢固問題。比如293T，平時貼壁就不是很牢，在裝滿的培養(yǎng)基瓶子里面，會發(fā)生大片的脫落，細胞聚集在一起，但是細胞生長還是正常的，通過離心收集，加以胰酶的消化，重新打散，又可以正常的貼壁生長。細胞接種或傳代以后，實驗者每天或至多間隔1～2d，要對細胞做常規(guī)性檢查。觀察細胞形態(tài)和生長情況以及培養(yǎng)的pH變化、有無污染等。根據細胞動態(tài)變化，做換液或傳代處理，如發(fā)現異常情況應及時采取措施。
2.當通過上一步的觀察，細胞初步沒有任何問題時，進行下一步操作。當收到的細胞密達到80%左右時，則處理如下：棄除瓶中大部分培養(yǎng)基，僅保留5到10mL培養(yǎng)所需的常規(guī)培養(yǎng)基；或更換新鮮的培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中，隨后每天觀察。 細胞在低于正常生長溫度情況下，會調整為靜止期，或者慢速生長期，必須恢復37度的環(huán)境至少3個小時左右，才能重新調整到接近對數生長期的狀態(tài)，在對數生長期進行細胞的傳代會大大增加傳代的成功率，和細胞的存活率。生長狀態(tài)良好的細胞，在一般顯微鏡下觀察時可見，細胞透明度大、折光性強、輪廓不清。細胞生長不良時，輪廓增強，胞質中常出現空泡、脂滴和其他顆粒狀物，細胞之間空隙加大，細胞形態(tài)可變得不規(guī)則甚至失去原有特點，如上皮細胞變成類上皮細胞等某些染料當細胞死亡時能透過變性的胞膜與解體的細胞核DNA結合，而令其著色。因而常用臺盼藍（trypan blue） 鑒別細胞死活，活細胞不著色，死細胞核呈藍色。
3.如果經*步觀察發(fā)現細胞密度超過90%，并且細胞狀態(tài)很好時，則復溫后2個小時需要立即傳代。傳代的比例應依據不同的細胞而定。對于生長比較快，狀態(tài)穩(wěn)定，不易受外界影響的細胞可以一次多傳幾瓶；對于生長較慢，細胞比較薄，狀態(tài)容易波動的細胞類型，一次少傳些，保證每瓶細胞密度大些，便于穩(wěn)定生長。至于一些比較陌生的細胞，*次處理也可以依照第二種情況。
細胞傳代操作：

操作間隔應讓無菌操作臺運轉10分鐘以上后，再進行下一個細胞株之操作；無菌操作工作區(qū)域應保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置，其它實驗用品用完即應移出，以利于氣流之流通。實驗用品以70%ethanol擦拭后才帶入無菌操作臺內。實驗操作應在抬面之中央無菌區(qū)域，勿在邊緣之非無菌區(qū)域操作。
1.吸除培養(yǎng)瓶內舊培養(yǎng)液。
2.加入無菌pbs洗液（5-8mL）輕輕潤濕細胞，稀釋多余的培養(yǎng)基，之后吸走洗液，動作要輕，不可吹打到細胞。
3.向瓶內加入含0.25%EDTA的胰蛋白酶混合液少許，以能覆滿瓶底為限。
4.置溫箱中2~5分鐘，一旦鏡檢發(fā)現細胞質回縮，細胞間隙增大后，細胞變圓，比較松動后，立即終止消化。
5.加入該細胞對應的培養(yǎng)基6mL（T25培養(yǎng)瓶）或12mL（T75培養(yǎng)瓶）終止消化。
6.用吸管通過吸取的培養(yǎng)基輕輕反復吹打瓶壁細胞，使之從瓶壁脫離形成細胞懸液。吹打時應盡量以zui少的次數將細胞從壁上吹下，不僅要控制吹打的力度、次數，還要注意要將細胞盡可能吹成單個。這樣既能減少死細胞，又能便于細胞再次均勻貼壁生長。
7.依據傳代比例，將細胞懸液分瓶，再補充培養(yǎng)基后，靜置于溫箱培養(yǎng)，直止貼壁。
 貼壁細胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后，繼續(xù)生長的空間不足，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成份也消耗較多，同時代謝廢物也有較多堆積，需要分瓶培養(yǎng)，對細胞進行傳代擴增。對于貼壁不太緊的細胞如293，可以直接吹散后分瓶。而對于貼壁較緊的細胞如CHO，則需要以胰酶消化后再吹散分瓶。以筆者的經驗，以輕吹或加培養(yǎng)液后輕搖可下較好，但對于經驗不太充分的實驗者而言是較難判斷掌握的。
   胰酶消化的程度是一個關鍵：消化過度則對細胞的活性影響較大，并有部分細胞漂浮，隨棄去的胰酶流失;消化不足則細胞難于從瓶壁上吹下，反復吹打同樣也會損傷細胞活性。影響消化速度的因素較多，主要有胰酶溶液的活性(配制條件、凍存或4℃保存時間長短、是否反復凍融、解凍后存放時間及溫度等)、消化時的溫度(氣溫、細胞培養(yǎng)瓶及胰酶溶液的溫度)以及所加胰酶溶液的多少等。含有EDTA的胰酶會比不含的消化能力強很多，不同細胞對消化液的敏感性也不同，比如HEP-G2人肝癌細胞，該細胞消化時間可長達10分鐘左右。 消化時間仔細去摸索一下，每過2分鐘鏡下觀察細胞是否變圓，記錄的時間，下一次操作參考之前的記錄來控制時間即可。對于懸浮細胞換液時只需要補液就行。
   懸浮細胞的傳代則不需要用胰酶消化，直接通過計數算好傳代的比例，直接分瓶，補液。有些懸浮細胞趨于成團生長，此時細胞生長狀態(tài)良好，當補液時，避免吹打。典型實例：jurkat就是成團生長。當jurkat細胞密度比較大時，可將培養(yǎng)瓶豎直放置2分鐘左右，待大部分細胞沉下，吸走上層清液，補充等量的新鮮培養(yǎng)基。而 HL-60 就不一樣了，為懸浮單個生長，如果發(fā)現該細胞包團，說明細胞狀態(tài)不好，不加以正確的處理，zui終會發(fā)生凋亡。 

希望我們的建議能給您帶來幫助！